Das Buch der Apostelgeschichte enthält die ausführlichsten Berichte über Ephesus. In Apostelgeschichte 18,18-21 besucht Paulus Ephesus zum ersten Mal, allerdings nur kurz. Er lässt Priszilla und Aquila dort zurück und reist weiter, nachdem er versprochen hat, zurückzukehren. Apostelgeschichte 19,1-41 bildet das Hauptkapitel über Ephesus. Es beschreibt Paulus‘ ausgedehnten und erfolgreichen, aber auch konfliktreichen Aufenthalt. In den Versen 19,1-10 wird berichtet, wie Paulus zwei Jahre lang täglich in der Schule des Tyrannus unterrichtete, so dass alle, die in der Provinz Asia lebten, das Wort des Herrn hörten. In 19,11-20 wirkt Gott außergewöhnliche Wunder durch Paulus. Die Söhne des Skevas versuchen, den Namen Jesu zu missbrauchen, was zu einer großen Bekehrungswelle und dem öffentlichen Verbrennen von Zauberbüchern führt. Der Abschnitt 19,21-41 schildert den Aufruhr des Silberschmieds Demetrius. Die Hersteller von Artemis-Schreinen fürchten um ihr Geschäft und lösen einen stadtweiten Aufstand aus, der im Theater von Ephesus gipfelt. Die Menge schreit stundenlang „Groß ist die Artemis der Epheser!“, bevor der Stadtsekretär die Menge schließlich beruhigt. In Apostelgeschichte 20,16-17 beschließt Paulus, auf seiner Rückreise nach Jerusalem nicht in Ephesus Halt zu machen, um Zeit zu sparen. Stattdessen lässt er die Ältesten der Gemeinde zu sich nach Milet kommen. Apostelgeschichte 20,18-38 hält die emotionale Abschiedsrede des Paulus an die Ältesten von Ephesus in Milet fest. Er warnt sie vor zukünftigen Problemen und verabschiedet sich mit der Gewissheit, sie nicht wiederzusehen. In Apostelgeschichte 21,29 wird schließlich erwähnt, dass man Paulus während seiner Festnahme in Jerusalem fälschlicherweise unterstellt, er habe den Epheser Trophimus mit ins Heiligtum genommen, was die Situation erheblich verschärft.